Manual Testes Antimicrobianos
Bactérias | Bactérias |
Manual testes Antimicrobianos. Elaborado pela Anvisa!
“ Provida Provendo Soluções Preservando Vidas. Proteção contra Vírus e Bactérias. Nanoclean é mais barato do que você pensa e é mais eficiente do imagina.”
Projeto de “Monitoramento e Prevenção da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde”
Coordenação do Projeto
Flávia Freitas de Paula Lopes – GGTES/ANVISA/MS
Adélia Aparecida Marçal dos Santos – GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Maria Cândida de Souza Dantas – CGLAB/SVS/MS
Valeska de Andrade Stempliuk – OPAS/OMS
Elaboração
Valeska de Andrade Stempliuk – OPAS/OMS
Colaboradores
Adélia Aparecida Marçal dos Santos – GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Antonia Maria Machado - Laboratório Central do Hospital São Paulo - UNIFESP
Eliete Frigatto - Laboratório Central do Hospital São Paulo - UNIFESP
Heiko Thereza Santana - GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Janaína Sallas – Coordenação Geral Laboratórios de Saúde Pública – DEVEP/CGLAB/SVS/MS
Márcia de Souza Carvalho Melhem – Instituto Adolfo Lutz / São Paulo SP
Maria Rita Elmor – Laboratório de Microbiologia do Hospital Sírio Libanês / São Paulo SP
Marinês Dalla Valle Martino – Hospital Israelita Albert Einstein / São Paulo SP
Sociedade Brasileira de Análises Clínicas
Revisão técnica
Heiko Thereza Santana – GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Janaína Sallas – DEVEP/CGLAB/SVS/MS
Sílvia Figueiredo Costa – Hospital das Clínicas – FM/USP
Suzie Marie Gomes – GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Valeska de Andrade Stempliuk – OPAS/OMS
Revisão de texto
Ana Beatriz de Noronha
Esta publicação está sendo realizada no marco do Termo de Cooperação 37 (TC 37) entre a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária / Ministério de Saúde e a Organização Pan-Americana da Saúde/Organização
Mundial da Saúde - Representação do Brasil.
Organização Pan-Americana da Saúde/Organização Mundial da Saúde
Setor de Embaixadas Norte, Lote 19, 70800-400 Brasília-DF
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www.opas.org.br
Lista de Siglas e abreviaturas
Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection
BaSO4 Sulfato de Bário
CCIH Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CGLAB Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIQ Controle Interno da Qualidade
CLSI Clinical Laboratory Standard Institute
CO2 Dióxido de Carbono
CQ Controle da Qualidade
CQIL Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais
DEVEP Departamento de Vigilância Epidemiológica
EPC Equipamentos de Proteção Coletiva
EPI Equipamentos de Proteção Individual
ESBL Beta-lactamase de Espectro Estendido
FM/USP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
GGTES Gerência-Geral de Tecnologia em Serviços de Saúde
GIPEA Gerência de Investigação e Prevenção das Infecções e dos Eventos Adversos
IEC International Electrotechnical Commission
ISO Internacional Standards Organization
MH Mueller-Hinton
MS Ministério da Saúde
OMS Organização Mundial da Saúde
OPAS Organização Pan-Americana da Saúde
PCIQ Programa de Controle Interno da Qualidade
pH Potencial Hidrogeniônico
POP Procedimento Operacional Padrão
SNVS Sistema Nacional de Vigilância Sanitária
SPVA Sucrose Fosfato Glutamato
SVS Secretária de Vigilância em Saúde
TSB Caldo de Soja Tríptica
UNIFESP Universidade Federal Escola Paulista
Implantação da Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde
Sumário
Introdução
1.
Parâmetros para um Programa de Controle da Qualidade M2 -I -1
I -Fase pré-analítica M2 -I -1
II -Fase analítica M2 -I -2
III - Fase pós-analítica M2 -I -4
2. Cepas de referência
M2 -I -4
2.1. Definições
M2 -I -4
2.2. Tabela 1. Indicação de uso das cepas de referência
M2 -I -5
Capítulo 1
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia
M2 -C1 -1
1. Cepas de referência
M2 -C1 -1
1.1. Manuseio e estocagem
M2 -C1 -1
2. Controle de Turbidez para a Preparo do Inóculo
M2 -C1 -4
3. Método de Disco-Difusão
M2 -C1 -4
3.1. Freqüência dos testes de controle da qualidade M2 -C1 -4
3.2. Teste de controle da qualidade dos meios de cultura
M2 -C1 -5
3.3. Testes de controle da qualidade da prova e do perfil de sensibilidade
M2 -C1 -6
4. Método de Diluição em Caldo ou Ágar (CIM)
M2 -C1 -8
4.1. Freqüência dos testes de controle da qualidade
M2 -C1 -9
4.2. Freqüência dos testes de controle da qualidade para testes de triagem M2 -C1 -9
4.3. Testes de controle da qualidade do meio de cultura
M2 -C1 -9
4.4. Método de diluição em ágar
M2 -C1 -9
4.5. Método de diluição em caldo (microdiluição e macrodiluição) M2 -C1 -10
4.6. Testes de controle da qualidade da prova e do perfil de sensibilidade
M2 -C1 -10
Capítulo 2
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras
M2 -C2 -1
1. Cepas de Referência
M2 -C2 -1
1.1. Cepas recomendadas para testes de CIM de 48 horas por diluição
emcaldo M2 -C2 -1
1.2. Cepas recomendadas para testes de CIM de 24 e 48 horas por
microdiluição em caldo M2 -C2 -1
1.3. Cepas recomendadas para disco-difusão M2 -C2 -1
2. Manuseio e estocagem das cepas de referência
M2 -C2 -1
2.1. Preparo das cepas de referência para armazenamento
M2 -C2 -1
2.2. Armazenamento das cepas de referência
M2 -C2 -2
2.3. Manuseio das cepas de referência nos testes de rotina
M2 -C2 -2
Tecnologia em Serviços de Saúde
m2 -
3. Freqüência dos Testes de Controle da Qualidade
M2 -C2 -3
3.1. Intervalos de CIM
M2 -C2 -3
3.2. Testes de sensibilidade a antifúngicos
M2 -C2 -3
4. Testes de controle da qualidade do Meio de Cultura e Artigos de Plástico M2 -C2 -4
5. Outros Testes de Controle utilizados na macrodiluição e microdiluição M2 -C2 -5
5.1. Controle do crescimento
M2 -C2 -5
5.2. Controle de pureza
M2 -C2 -5
5.3. Controle da leitura dos pontos finais da reação
M2 -C2 -5
6. Teste de qualidade da prova e do perfil de sensibilidade
M2 -C2 -5
Capítulo 3
Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizado por
Métodos Automatizados M2 -C3 -1
1. Elementos essenciais do sistema de gestão da qualidade
M2 -C3 -1
1.1 Fase pré-analítica
M2 -C3 -1
1.2. Controle interno do laboratório
M2 -C3 -1
1.3. Controle da qualidade dos processos automatizados
M2 -C3 -1
1.4. Validação
M2 -C3 -2
Referências Bibliográficas
M2 -RB -1
Anexos
M2 -A -1
Anexo I:
Procedimentos utilizados para manutenção e estocagem de
microrganismos M2 -A -1
Anexo II:
Planilhas para controle interno da qualidade M2 -A -3
Anexo III: Relatórios de Registro da Realização do Controle Interno da
Qualidade -Hospital M2 -A -15
Anexo IV:
Relatórios de Registro da Realização do Controle Interno da
Qualidade -LACEN M2 -A -19
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m2 -
Introdução
O programa de controle interno da qualidade é um conjunto de ações que visam garantir a qualidade e reprodutibilidade dos processos e dos resultados produzidos por meio da verificação continua dos fatores que interferem nessa. Deve ser visto como uma oportunidade de aprimoramento
das atividades desenvolvidas no laboratório. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS)1 a implantação de um programa da qualidade é necessária para:
•melhorar a qualidade dos serviços de saúde;
•gerar resultados confiáveis e reproduzíveis;
•propiciar que resultados interlaboratoriais sejam comparáveis;
•aumentar a credibilidade do laboratório entre os médicos e seus clientes;
•motivar os funcionários a melhorar o desempenho; e
•Prevenir de complicações legais que podem seguir a liberação de exames de baixa qualidade.
Muitos fatores interferem na qualidade dos resultados liberados pelo laboratório de microbiologia,
como por exemplo: (a) a seleção, coleta, transporte e acondicionamento apropriados do espécime
biológico; (b) o treinamento, comprometimento e motivação do pessoal de laboratório; (c) fatores
mbientais, como luminosidade deficiente ou excessiva, ventilação e condições do local de trabalho;
(d) fatores analíticos, como baixa qualidade dos reagentes, vidraria, corantes, meios de cultura e falta
de equipamentos precisos; e (e) erros de transcrição de resultados, resultados liberados incompletos
e interpretação errada das provas bioquímicas ou antibiograma1.
Este guia é um instrumento que tem como objetivo oferecer subsídios aos laboratórios de microbiologia
na elaboração do manual de procedimentos operacionais padrão (POP) que deve ser construído
pelo laboratório. Ele faz parte do Manual de Microbiologia Clínica para o controle de infecção em serviços
de saúde elaborado e disponível na página eletrônica da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa)
2. Este deve ser utilizado em consonância com a Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI),
Boas Práticas de Laboratórios, Norma Brasileira Reguladora -NBR ISO/ IEC 17025 por microbiológicos
e biológicos e Resolução Diretoria Colegiada -RDC 302, de 13 de outubro de 2005.
Os documentos aqui apresentados contêm informações básicas acerca da realização, da freqüência
e das indicações dos testes de controle interno da qualidade (CIQ) dos laboratórios de microbiologia
clínica, na fase analítica.
1. ParâMeTroS Para uM PrograMa de CoNTroLe da QuaLIdade2,3
I -FaSe Pré-aNaLíTICa
a) garantia da qualidade das amostras clínicas
O laboratório de Microbiologia deve elaborar um manual de instruções, contemplando os
seguintes itens:
• coleta, identificação e conservação da amostra;
• transporte da amostra, estabelecendo meio recomendado, prazo, condições de temperatura
e padrão técnico para garantir a sua integridade e estabilidade;
•critérios para o preparo do cliente com instruções claras e escritas em linguagem acessível, sendo
que somente as instruções simples e de fácil compreensão podem ser dadas verbalmente;
•critérios para a aceitação ou rejeição das amostras; e
• documentação das informações relacionadas às amostras coletadas, como data, horário e
responsável pela coleta e eventuais intercorrências, garantindo sua rastreabilidade durante
todo o processo.
II -FaSe aNaLíTICa
a) Manual de Procedimentos operacionais Padrão (PoP)
O laboratório de Microbiologia deve elaborar os documentos internos de procedimentos,
seguindo as indicações de GP2-A4 do CLSI (Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals; Approved
Guideline - Fourth Edition (2002) e deste documento.
•OsPOP´sdeverãoconter,nomínimo:técnica,limitesdetolerância,aceitaçãoerejeiçãodaamostra,
preparo de reagentes, controle de qualidade (CQ), cálculos, critérios de liberação de resultados.
•Revisar os documentos, anualmente, ou sempre que ocorrer mudanças nos processos descritos.
•Disponibilizar as informações escritas no ambiente de trabalho.
B) garantia da qualidade técnica dos colaboradores
•Oferecer e documentar capacitação técnica para as atividades desempenhadas na rotina do
laboratório de microbiologia.
•Manter programa de capacitação para o uso apropriado de equipamentos.
•Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI) e equipamentos de proteção coletiva
(EPC) e cumprir as normas de biossegurança.
•Participar ativamente junto à Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH), fornecendo
dados epidemiológicos de diferentes agentes etiológicos de infecção hospitalar e seus
perfis de sensibilidade.
•Armazenar cepas de interesse para estudos.
•Os resultados dos procedimentos e testes devem ser conferidos quanto à exatidão, reprodutibilidade
e concordância com os padrões de CQ pelo responsável designado.
C) desempenho dos equipamentos e instrumentos
•Elaborar e manter um programa de manutenção preventiva e corretiva dos equipamentos.
•Manter registro diário de temperaturas dos equipamentos de banho-maria, estufa, freezer,
geladeira e meio ambiente.
•Fazer controle da eficácia do processo de esterilização das autoclaves (Bacillus stearothermophilus).
•Dispor de manual de funcionamento do equipamento em português.
•Estabelecer cronograma de manutenção preventiva.
•Registrar a manutenção preventiva e corretiva dos equipamentos em uso.
•Documentar o estado de calibração dos equipamentos e instrumentos usados nos processos
analíticos, como pipetas automáticas e pipetadores, termômetros, centrífugas, microscópios,
espectrofotômetros, turbidímetro, balanças analíticas, pHmetro, equipamentos analíticos, etc.
•Documentar a verificação do funcionamento do equipamento.
•Documentar a realização da limpeza dos equipamentos.
•Manter e documentar a higienização periódica de fluxos, cabines de segurança, capelas,
geladeiras, freezer, banho-maria, centrífugas, estufas, etc.
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m2 - I - 2
•Documentar a utilização de cepas de referência para o CIQ de acordo com as especificações do equipamento.
•Documentar alertas emitidos pelo equipamento.
•Atualizaa software a cada mudança, documentando as modificações.
• Definir os limites de aceitabilidade para as inexatidões encontradas nas calibrações, verificações e comparações entre equipamentos, e garantir a implementação de ações corretivas para os eventuais desvios.
d) Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais (CQIL)
D1. Corantes e reagentes
•Respeitar as orientações escritas dos fabricantes para o uso dos reagentes.
•Solicitar cópia dos laudos qualitativos junto ao fabricante para cada lote recebido.
•Rotular cada produto com: nome, número do lote, concentração, condições de estocagem,
data do preparo, recebimento, quando foi colocado em uso e prazo de validade.
•Testar com controles positivos e negativos antes do uso, conforme o tipo de teste.
•Se os resultados não forem satisfatórios notificar o fornecedor e o SNVS.
• Descartar o produto se o controle não estiver apropriado.
• Definir e documentar o grau de pureza da água reagente utilizada nas análises, assim
como a forma de obtenção e controle dessa água.
D2. Meios de cultura
•Documentar a quantidade de meio preparado no laboratório, número do lote, método de
esterilização, data do preparo, pH, validade e técnico responsável pela preparação.
•Realizar e documentar teste de esterilidade e desempenho dos meios preparados no laboratório,
utilizando cepas de referência, tipo ATCC.
•Observar o meio quanto a cor, consistência, profundidade e/ou superfície, hemólise, presença
de bolhas e contaminação.
•Documentar o número do lote e a data de recebimento dos meios comerciais. Solicitar ao fornecedor
o ertificado de controle de qualidade, conforme recomendações do CLSI.
• Documentar os meios que não estejam de acordo com os padrões, as ações corretivas tomadas
e informar ao fornecedor e ao SNVS. D3. Discos e fitas E-test
• Testar os discos ou fitas E-test de antimicrobianos, cartões ou painéis com antibióticos, diariamente,
por 20 dias consecutivos, a fim de validar a metodologia. Utilizar cepas de referência, tipo ATCC.
• Seguir, rigorosamente, as recomendações do fabricante quanto ao armazenamento dos
discos antimicrobianos.
• Documentar os discos de antimicrobianos que não estejam de acordo com os padrões CLSI,
as ações corretivas tomadas e informar ao fornecedor e SNVS.
D4. Kits comerciais e anti-soros
•Verificar se há registro do kit junto ao ministério da saúde www.anvisa.gov.br
• Testar os kits e anti-soros de um novo lote em paralelo com o lote anterior ou com cepas de
referência, antes de colocá-los em uso. Utilizar controles positivos e negativos, juntamente
com cepas de referência recomendadas. Documentar os resultados desses testes.
Tecnologia em Serviços de Saúde
m2 - I -
•Seguir as recomendações do fabricante para o teste do controle da qualidade.
•Registrar as informações contidas no rótulo do Kit para rastreabilidade do processo.
•Notificar ao fornecedor e SNVS os desvios de qualidade encontrados. III -FaSe PóS-aNaLíTICa
• Documentar a liberação de resultados, emissão e entrega de laudos.
•Garantir a confidencialidade dos resultados dos laudos.
• Fornecer aos colaboradores uma avaliação periódica de desempenho do laboratório no
controle interno, verificando a abrangência e adequação desses controles.
2. CePaS de reFerêNCIa6,7
2.1. deFINIçõeS6
As cepas de referência destinam-se à verificação dos resultados obtidos, pois suas características
fenotípicas já são conhecidas, ou seja, sua identificação e seu perfilde
sensibilidade já foram determinados.
As cepas de referência devem possuir uma origem confiável, vindo de um laboratório de referência
que realiza testes fenotípicos e moleculares para confirmar sua identificação e perfil de
sensibilidade.
Define-se como cultura de estoque o subcultivo das cepas de referência. Essa cultura é armazenada
no laboratório de microbiologia (a -20oC ou menos) e é descongelada anualmente.
A cultura de trabalho é o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque e será mantida
no laboratório (4oC a 8oC) para realização dos testes diários ou semanais de CIQ.
Uma passagem é a transferência do organismo de uma cultura viável para um novo meio
de cultura com crescimento de microrganismos. A hidratação (ou decongelamento) de uma cepa de
referência não é considerada uma passagem ou repique. A primeira passagem será o subcultivo da
cepa de referência para a cultura de estoque. A transferência do microrganismo da cultura de estoque
para a cultura de trabalho será a segunda passagem (Figura 1).
Figura 1. ProPagação da CuLTura de BaCTérIaS4
Cepa de referência Cultura de estoque Cultura de trabalho
1ª passagem 2ª passagem
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m2 - I -
Microrganismos
Gram-negativos
2.2. Tabela 1: INdICação de uSo daS CePaS de reFerêNCIa4,5
Teste indicado
E. coli ATCC 25922
-Cepa não produtora de ß-lactamase.
E. coli ATCC 35218
- Cepa produtora de ß-lactamase
• Qualidade da prova de DD e CIM para de
ß-lactâmicos e inibidores de ß-lactamase
• Qualidade da prova de DD e CIM para Amoxacilina
-Ac. clavulânico de Haemophilus spp
• VITEK GNS MIC painel QC set
Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda do plasmídeo
• Testes automatizados para inibidores de
ß-lactamase em painéis de gram-negativos
E. coli ATCC 51446 • Testes automatizados de para ESBL
K. pneumoniae ATCC 13883 • Qualidade da prova em testes automatizados de
identificação de bacilos gram-negativos
K. pneumoniae ATCC 700603
-Cepa produtora de ß-lactamase de espectro ampliado
Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda do plasmídeo
P. aeruginosa ATCC 27853
Sensível aos agentes anti-pseudomas
• Qualidade da prova de DD e CIM de enterobactérias
• Qualidade da prova de DD e CIM de Pseudomonas, Acinetobacter, S. maltophilia e
Burkholderia
• Qualidade da prova de DD e CIM de Vibrio colerae
• Testes de triagem e confirmatório de ESBL
• Qualidade da prova em testes automatizados de susceptibilidade em painéis de gram negativos
• Testes de triagem e teste confirmatório de ESBL
• Qualidade da prova em testes de diluição em caldo e diluição em ágar de P. aeruginosa e outros não-enterobacteriaceas
• Testes automatizados para verificação da concentração de cátion e pH com aminoglicosídeos em painéis de gram-negativos P. mirabilis ATCC 7002
• Qualidade da prova em testes automatizados de identificação de bacilos gram-negativos
Microrganismos Gram-positivos
2.2. Tabela 1: INdICação de uSo daS CePaS de reFerêNCIa4,5
Teste indicado
E. faecalis ATCC 29212
-Sensível a vancomicina, ampicilina e altos níveis de aminoglicosídeos
• Adequação do meio para testes de sulfonamidas e trimetropim, DD e CIM
• Qualidade da prova de CIM para Enterococcus spp
• Teste de triagem de alto nível de resistência aos aminoglicosídeos e à vancomicina
• Qualidade da prova em testes automatizados de identificação e susceptibilidade de gram-positivos
E. faecalis ATCC 51299
- Resistente a vancomicina e altos níveis de aminoglicosídeos
• Teste de triagem de alto nível de resistência aos aminoglicosídeos e à vancomicina
• Testes automatizados de susceptibilidade a vancomicina para gram-positivos S. aureus ATCC 25923
-Cepa não produtora de ß-lactamase
• Qualidade da prova em testes de DD para Staphylococcus spp, Enterococcus spp
S. aureus ATCC 29213
- Cepa produtora de ß-lactamase
• Qualidade da prova em testes de CIM para Staphylococcus spp
•Teste confirmatório de susceptibilidade a Oxacilina
• Qualidade da prova em testes automatizados de identificação susceptibilidade de gram-positivos
S. aureus ATCC 43300
- Resistente a oxacilina
• Teste confirmatório de susceptibilidade a Oxacilina S. pneumoniae ATCC 49619 • Qualidade da prova de DD da susceptibilidade de S.
- Intermediário para penicilina pneumoniae ou Streptococcus spp
Leveduras
C. albicans ATCC 14053 • Qualidade da prova em testes automatizados de
identificação de leveduras
C. parapsilosis ATCC 22019 • Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
CIM e DD de fluconazol
C. kruzei ATCC 6258 • Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
CIM de leveduras C. albicans ATCC 90028 • Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
DD de fluconazol
C. tropicalis ATCC 750 • Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
DD de fluconazol
Capítulo 1
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia
1. CePaS de reFerêNCIa
1.1. MaNuSeIo e eSToCageM
As cepas de referência têm um número máximo de gerações a qual podem ser submetida, são cinco passagens a partir da cepa de referência original6.
O número indefinido de passagens pode comprometer principalmente a pureza da cultura e as características fenotípicas de algumas bactérias.
Seguindo os procedimentos descritos neste documento e em condições ideais de armazenagem, a passagem para a produção das culturas de estoque pode ser anual e a passagem das culturas de trabalho pode ser realizada a cada três semanas.
Algumas cepas devem ser mantidas em condições especiais devido a suas características intrínsecas (ex. cepas exigentes).
• As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e métodos empregados para testes de isolados clínicos.
• No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referência devem ser mantidas a temperatura de -20oC, ou menos, (de preferência a -60oC ou menos, ou em nitrogênio líquido) em meio estabilizador recomendado.
• Meios utilizados para a manutenção das cepas de referência (Figura 2):
. Skin milk a 20% (p/v) de leite desnatado em pó dissolvido em água destilada, autoclavar
a 121oC por 20 minutos.
. Caldo de soja tríptica a 10 - 20% de glicerol (v/v), autoclavar 121oC por 20 minutos.
. Sangue de coelho desfibrinado.
• OBS: Os criotubos com selo de proteção interna são os mais utilizados para o processo de armazenamento
dessas amostras. Os criotubos são preparados com antecedência, em volumes que
em geral estão em torno de 0,5mL por tubo, e previamente testados quanto à esterilidade.
A)Partindo da cepa original liofilizada:
• Ressuspender a cepa liofilizada, conforme as recomendações do fabricante.
• Homogenizar o frasco. • Semear em meio de cultura específico (Ágar Sangue,
MacConkey ou Ágar Chocolate).
• Fazer dois repiques.
• Identificar através de provas bioquímicas manuais ou automatizadas e coloração
de Gram.
• Realizar testes de sensibilidade antimicrobianos.
• Depois de certificar a identificação e os testes de sensibilidade,
armazenar a cepa.
• Transferir as colônias recentes de 18 a 24 horas, em 15 frascos estéreis (criotubos), para cada cepa de referência a ser utilizada no controle.
• Etiquetar os frascos com o nome do microrganismo, número da cepa de referência, a data
do armazenamento e o mês a ser utilizado (janeiro a dezembro). Nos outros três frascos,
colocar a data dos três anos seguintes para realizar o mesmo procedimento.
• Armazenar em freezer –20oC ou – 60oC (Figura 2).
Figura 2. FLuxograMa Para MaNuSeIo e eSToCageM da CePa de reFerêNCIa
2 placas de Ágar
específico+1Ágar Seletivo
IdentificaçãoeconfirmaçãoProvas Bioquímicas e
Coloração de Gram
Testedeperfildesensibilidade
(Antibiograma)
2º Repique
Validação
Fazer o banco
2006
2007
2008
ATCC liofilozada
Hidratar Ágar de acordo com o microrganismo específico
1º Repique Verificar a viabilidade, pureza das colônias
Jan.
Fev.
Mar.
Abr.
Mai.
Jun.
Jul.
Ago.
Set.
Out.
Nov.
Dez.
Armazenar todas
Freezer - 20ºC ou - 60ºC
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m2 - C - 2
B) Partindo da cepa congelada:
• Retirar o criotubo com a cepa (ex.: janeiro) do freezer e com o auxílio de uma alça bacteriológica, semear a amostra ainda congelada em meio específico.
•Incubar a placa por 18 a 24 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.
•Fazer um segundo repique utilizando duas placas.
•Numa das placas, fazer os testes de sensibilidade a antimicrobianos (para a 1ª semana).
•Na outra placa, semear a cepa em três tubos de Ágar Müeller Hinton inclinado.
•Incubar por 18 a 20 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.
•Colocar esses tubos na geladeira ( 2 a 8oC) para serem utilizados nos testes de sensibilidade
aos antimicrobianos para a 2a, 3a e 4a semanas do mês, repicar apenas uma vez.
•Esse procedimento deve ser realizado para todas as cepas envolvidas no CIQ (Figura 3).
•OBS: As culturas congeladas ou liofilizadas devem ser cultivadas duas vezes antes
de se realizar os testes de sensibilidade.
• Atenção especial à manutenção do organismo (subcultivo mínimo) e seu armazenamento (ex.-60oC ou menos) são particularmente importantes para as cepas CIQ E. coli ATCC 35218 e K. pneumoniae ATCC 700603, visto que tem sido documentada a perda espontânea do plasmídeo que codifica a ß-lactamase.
• Deve-se preparar um novo lote de cultivos se forem obtidos resultados aberrantes.
Figura 3. FLuxograMa Para MaNuSeIo da CePa de reFerêNCIa No CoNTroLe da QuaLIdade
1º Repique
2º Repique
Ágar MH inclinado O 2º repique é para o uso na 1ª semana 2ª semana 3ª semana 4ª semana
Geladeira
Tecnologia em Serviços de Saúde
m2 - C -
2. CoNTroLe de TurBIdez Para a PreParo do INóCuLo 7
Para padronizar a densidade do inóculo para um teste de sensibilidade, deve-se usar um controle de turbidez de BaSO4, equivalente a uma solução padrão 0,5 de McFarland ou seu equivalente óptico (ex., suspensão de partículas de látex). A solução padrão 0,5 de McFarland de BaSO4 pode ser
preparada da seguinte maneira.
•Acrescenta-se uma alíquota de 0,5mL de BaCl2 0.048 mol/L (1,175% v/v BaCl2 • 2H2O) a 99,5mL de H2SO4 0,18mol/L (1% v/v), homogeneizando constantemente para manter a suspensão.
•A densidade correta do controle de turbidez deve ser verificada usando um espectrofotômetro com fonte de luz de 1-cm e cubeta apropriada para determinar a absorbância. A absorbância da solução padrão 0,5 de McFarland deverá variar de 0,08 a 0,10 utilizando um comprimento de onda de 625 nm.
•A suspensão de sulfato de bário deve ser transferida, em alíquotas de 4 a 6 mL, para tubos com tampas de rosca do mesmo tamanho usados para cultivar e diluir o inóculo bacteriano.
•Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, à temperatura ambiente.
•O controle de turbidez de sulfato de bário deve ser agitado vigorosamente num misturador mecânico tipo vórtex antes de cada uso, verificando se está uniformemente túrbido.
No caso de precipitação visível, o controle deve ser substituído. As suspensões de partículas de látex devem ser misturadas invertendo-as suavemente, e não num misturador tipo vórtex.
•Os controles de sulfato de bário devem ser substituídos, ou suas densidades verificadas, todo mês.
3. MéTodo de dISCo-dIFuSão
O método de Kirby-Bauer ou disco-difusão é recomendado para algumas combinações microrganismo/
antimicrobiano e é muito utilizado em nosso meio. Sua praticidade, baixo custo e facilidade
operacional facilitam a implantação deste método nos laboratórios de microbiologia clínica.
Alguns fatores relacionados ao preparo do meio de cultura e sua composição podem interferir
no resultado final liberado pelo laboratório. A confirmação da qualidade, esterilidade e
composição do meio de cultura devem ser avaliadas através dos testes de CIQ.
3.1. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade
A freqüência dos testes de CIQ deve ser no mínimo mensal. Entretanto, as recomendações
nacionais e internacionais2,6 preconizam testes semanais. Essas recomendações devem ser seguidas
se a estrutura ou a capacidade do laboratório permitir.
A introdução do programa de CIQ inicia-se com a realização de testes diários, passando, em
fase posterior, para a realização mensal dos testes.
•Teste diário -Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos
e documentar os resultados.
•Para passar a realização dos testes de diária para mensal nenhuma das cinco leituras de halos,
para cada combinação de agente/antimicrobiano, pode estar fora dos limites aceitáveis.
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m2 - C -
•Teste mensal - Testar todas as cepas de CIQ no mínimo mensalmente e sempre que qualquer
novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo lote de ágar ou meio, um novo lote
de discos ou outro fabricante de insumos).
•Documentar a realização dos testes de controle da qualidade, anotando os números dos lotes,
meios de cultura, reagentes, discos de antibióticos testados nas respectivas datas e mês.
•Sempre que algum resultado dos testes mensal de controle da qualidade estiver fora da faixa
aceitável, faz-se necessário implantar ação corretiva6.
•Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanças importantes
no método de leitura dos resultados dos testes, estes devem ser realizados por cinco
dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqüência mensal.
3.2. TeSTe de CoNTroLe da QuaLIdade doS MeIoS de CuLTura6
a) Meio de cultura O meio indicado para os testes de disco-difusão em organismos não
fastidiosos é o Ágar Müeller-Hinton (MH).
B)espessura
A espessura do meio deve ser de 4 mm uniformemente distribuída. Volumes médios utilizados:
60 a 70 mL / placa de 150 mm e 25 mL / placa de 90 mm.
C) esterilidade
• Após preparo das placas, examinar uma amostra significativa (10%) e aleatória de
cada lote das placas para confirmar sua esterilidade, mediante sua incubação a 30°C
-35°C por, pelo menos, 24 horas.
• As placas devem ser usadas até sete dias após o preparo, a não ser que sejam tomadas precauções
adequadas, como embrulhá-las em saco plástico, para minimizar o ressecamento do ágar.
d) pH
• O pH de cada lote de Ágar Müeller-Hinton deve ser verificado quando o ágar é preparado.
O meio ágar deverá ter pH entre 7,2 e 7,4 a temperatura ambiente após solidificação.
• A medida do pH deve ser feita preferencialmente através de pHmetro apropriado, submerso
em porção de meio solidificado à temperatura ambiente. Caso esteja fora das especificações,
deve-se checar a procedência do meio, a qualidade da água e, eventualmente, preparar novo
lote seguindo estritamente as recomendações do fabricante6.
• Métodos de verificação de pH (ver CLSI Norma M2-A96 ou norma substituta):
. Macerar uma quantidade suficiente de ágar para submergir a ponta de um eletrodo do
pHmetro calibrado.
. Ou permitir que uma pequena quantidade de ágar solidifique-se em torno da ponta
de um eletrodo do pHmetro calibrado.
.Ou em um béquer contendo o ágar usar um eletrodo de superfície devidamente calibrado.
e)efeitos da timidina ou timina
•Excesso dessas substâncias pode levar a falsas resistências para sulfa-trimetoprim. Portanto,
deve-se usar meio Ágar Müeller-Hinton com o menor teor possível de timina ou timidina
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•O teor de timidina ou timina deve ser testado com Enterococcus faecalis ATCC 29212
com discos de sulfametaxol/trimetoprim. Um meio satisfatório produzirá halos de inibição
nítidos com diâmetro = 20 mm.
F) Defeitos de Variação nos Cátions divalentes
• As variações nos cátions divalentes, principalmente magnésio e cálcio, afetarão os resultados
dos testes dos aminoglicosídeos e da tetraciclina e variação nos níveis de cálcio também
afeta os resultados dos testes de daptomicina. Realizar teste de qualidade da prova para
estes agentes antimicrobianos.
G) Armazenamento de Discos Antimicrobianos Os discos devem ser armazenados conforme indicado a seguir.
•Refrigerar os recipientes a temperatura de 8°C ou menos, ou congelar a -15°C ou mais frio,
num congelador comum (não do tipo “frost-free”) até o momento de usar.
•Os pacotes fechados de discos contendo drogas da classe de ß-lactâmicos devem ser armazenados
congelados, com exceção de um pequeno número de discos reservados para o trabalho
cotidiano, que pode ser refrigerado (entre +4oC e +8oC) durante, no máximo, uma semana.
•Alguns agentes lábeis (ex., combinações de ácido clavulânico, carbapenêmicos e cefaclor)
devem ser armazenados congelados até o uso.
•Os recipientes fechados de discos devem ser retirados da geladeira ou congelador uma ou
duas horas antes de serem usados, para que se equilibrem em temperatura ambiente antes
de serem abertos.
•Após retirar o cartucho de discos do pacote selado, colocá-lo num dissecador.
•Quando se usa um dissecador, este deve ser tampado hermeticamente, acrescentando-se
um dissecante recomendado. Deve-se deixar que a temperatura do dispensador chegue à
temperatura ambiente antes de abri-lo. Evitar umidade excessiva, substituindo o dissecante
sempre que o indicador mudar de cor.
•Quando não estiver em uso, o dispensador de discos deve ser mantido refrigerado.
•Apenas os discos dentro do prazo de validade do fabricante podem ser usados. Os discos
devem ser descartados no vencimento.
3.3. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade
Falhas na detecção do padrão de resistência podem estar relacionadas a diversos fatores como:
má qualidade do meio de cultura, disco com baixa concentração de antimicrobiano, falhas no procedimento,
inóculo com concentração de microrganismos fora do preconizado, tempo e temperatura
de incubação inapropriados.
O controle da acurácia dos testes realizados deve ser feito utilizando-se as cepas referência para
o gênero ou espécie do microrganismo ou classe de antimicrobiano que está sendo testado.
Serão testados os antimicrobianos que fazem parte do antibiograma utilizado na rotina do
laboratório. Ex. Se o laboratório testa para Enterococcus spp ampicilina, ciprofloxacina,
clorafenicol, teicoplanina, vancomicina, quinupristin/dalfopristin, estes mesmos antimicrobianos serão testados
com a cepa referência S. aureus ATCC 25923 (ver abaixo) para avaliar a qualidade da prova realizada,
e os halos encontrados serão comparados com os valores de referência7.
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Os limites aceitáveis para os halos encontrados para as cepas de referências e os diversos antimicrobianos
são descritos em CLSI norma M100-S167 ou norma substituta.
a) Condições dos testes de controle da qualidade e cepas de referência
usadas para monitorar a acurácia dos testes de disco difusão enterobactérias
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0,5 de McFarland
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas
•Cepas referência: E. coli ATCC 25922 e E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/
inibidor de ß-lactamase)
Detecção de eSbl em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis
Testes de triagem e confirmatório de ESBL
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas
•Cepas de referência: E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603
P. aeruginosa
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas
•Cepas de referência: P. aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922 e/ou E. coli ATCC
35218 (para combinações ß-lactâmicos/inibidor de ß-lactamase)
Acinetobacter spp, S. maltophilia e B. cepacia
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 20 a 24 horas
•Cepas de referência: P.aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922 e/ou E. coli ATCC
35218 (para combinações ß-lactâmicos/inibidor de ß-lactamase)
Staphylococcus spp
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão de 0,5 de McFarland.
•Incubação: 33 a 35oC, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para oxacilina, cefoxitina,
meticilina, nafcilina e vancomicina.
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•Cepas de referência: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/
inibidor de ß-lactamase), S. aureus ATCC BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de indução
à clindamicina)
.Enterococcus spp Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma
solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para vancomicina.
•Cepas de referência: S. aureus ATCC 25923; E. faecalis ATCC 29212 para os testes de detecção
de resistência a altos níveis de aminoglicosídeos. S. pneumoniae ou Streptococcus spp
• Meio: Ágar Müeller-Hinton com 5% de sangue de carneiro
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0,5
de McFarland.
• Incubação: 35oC± 2 graus, CO2 a 5%, de 20 a 24 horas.
• Cepas de referência: S. pneumoniae ATCC 49619
Haemophilus influenzae e H. parainfluenzae
• Meio: Haemophilus Test Medium ( HTM ) – ver CLSI Norma M2-A9
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0,5
de McFarland
• Incubação: 35oC± 2 graus, CO2 a 5%, de 16 a 18 horas.
• Cepa de Referência: H. influenzae ATCC 49247, H. influenzae ATCC 49766, E. coli ATCC
35218 (quando testar amoxacilina - ácido clavulânico).
4. MéTodo de dILuIção eM CaLdo ou Ágar (CIM)
Os testes de diluição em caldo ou em ágar são utilizados para a determinação da sensibilidade in
vitro de um microrganismo a um agente antimicrobiano. Por este método se determina a concentração
inibitória mínima (CIM) de um antimicrobiano, ou seja, a menor concentração de antimicrobiano que
inibe o cresciento de um microrganismo. Esse método é também utilizado na confirmação de alguns
perfis de resistência detectados inicialmente por disco-difusão.
Falhas na detecção do padrão de resistência pelos métodos dilucionais podem estar relacionadas
a diversos fatores, como: má qualidade do meio de cultura, concentração de cátions ou pH fora da faixa
recomendada, baixa concentração de antimicrobiano, solução estoque de antibiótico com concentração
fora do preconizado, falhas no procedimento técnico, inóculo com concentração de microrganismos
fora do preconizado, tempo e temperatura de incubação não recomendadas.
Os testes de CIQ avaliam os parâmetros críticos para a detecção da resistência. E devem ser
realizados nas mesmas condições e pelo mesmo pessoal técnico que realiza os testes de rotina.
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4.1. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade 3,6
A freqüência dos testes de CIQ deve ser no mínimo mensal. Entretanto, as recomendações
nacionais e internacionais2,6 preconizam testes semanais. Essas recomendações devem ser seguidas
se a estrutura ou a capacidade do laboratório permitirem.
A introdução do programa de CIQ inicia-se com a realização de testes diários, passando, em
fase posterior, para a realização mensal dos testes.
• Teste diário – Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos
e documentar os resultados.
• Para passar os testes de diários para mensais nenhuma das cinco leituras de CIM para cada
combinação de microrganismo/antimicrobiano pode estar fora dos limites aceitáveis.
• Teste mensal – Testar todas as cepas de controle no mínimo mensalmente e sempre que
qualquer reagente do teste for utilizado (ex. um novo lote de ágar ou meio, um novo lote de
antimicrobianos ou outro fabricante de insumos).
• Sempre que algum resultado dos testes mensais de controle de qualidade estiver fora da
faixa aceitável, faz-se necessário implantar ação corretiva3
• Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanças importantes
no método de leitura dos resultados dos testes (ex.conversão de leitura visual da CIM
para leitura instrumental ou mudança no tipo de painel usado), estes devem ser realizados por
cinco dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqüência mensal.
4.2. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe de QuaLIdade Para TeSTeS de TrIageM
• Testes em placas para triagem de resistência a vancomicina e de resistência de alto-nível de
aminoglicosídeos podem ser realizados no mínimo mensalmente, desde que o laboratório
realize os testes rotineiramente e os critérios de mudança do sistema de teste de diário para
mensal tenham sido atingidos.
• Se o teste de triagem não for realizado rotineiramente (< que uma vez/semana) ou se o agente
antimicrobiano for lábil (ex. ampicilinas, meticilinas, imipenem, ácido clavulânico, ceflacor
e cefamandole), será necessária a realização de testes de controle de qualidade sempre que
o teste de triagem for realizado em amostras clínicas.
4.3. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade do MeIo de CuLTura
4.4. MéTodo de dILuIção eM Ágar8
• Os meios indicados para os testes de diluição em Ágar são: Ágar Müeller-Hinton ou Ágar
Müeller-Hinton com sangue lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de carneiro a 5%.
a)esterilidade
• Após preparo das placas, examinar uma amostra significativa de cada lote (10%) para confirmar
sua esterilidade, mediante sua incubação a 30°C-35°C, por pelo menos 24 horas.
As placas devem ser usadas até sete dias após o preparo, a não ser que sejam tomadas
precauções adequadas, como embrulhá-las em saco plástico e protegê-las da luz quando
o antimicrobiano é fotossensível.
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m2 - C -
B) pH
• O pH de cada lote de placas de Ágar Müeller-Hinton ou Ágar Müeller-Hinton com sangue
lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de carneiro a 5% deve ser verificado quando o
ágar for preparado. O meio ágar deverá ter pH entre 7,2 e 7,4 à temperatura ambiente
após solidificação.
•
A medida do pH deve ser feita preferencialmente através de pHmetro apropriado, submerso
em porção de meio solidificado à temperatura ambiente. Caso esteja fora das especificações,
deve-se checar a procedência do meio, a qualidade da água e, eventualmente, preparar novo
lote, seguindo-se estritamente as recomendações do fabricante.
•Métodos de verificação de pH – ver CLSI Norma M7-A7 ou norma substituta.
4.5. MéTodo de dILuIção eM CaLdo (MICrodILuIção e MaCrodILuIção) 8
• O meio indicado para os testes de diluição em caldo é Müeller-Hinton.
a)esterilidade
•Após preparo do meio, examinar uma amostra significativa e aleatória (10%) de cada
lote para confirmar sua esterilidade, mediante sua incubação a 30°C-35°C por, pelo
menos, 24 horas.
B) pH
• O pH de cada lote de caldo Müeller-Hinton deve ser verificado quando o meio for
preparado.
O meio deverá ter pH entre 7,2 e 7,4 à temperatura ambiente.
C) efeitos da timidina ou timina
•Para determinar a adequação do meio para testes de sulfonamida e trimetropim, os testes
de CIM podem ser realizados com E. faecalis ATCC 29212.
Os pontos finais devem ser de fácil leitura (com uma redução de 80% ou mais no crescimento,
quando comparado com o controle). Se a CIM para trimetoprim-sulfametoxadol for = 0,5/0,95µg/mL,
o meio poderá ser considerado apropriado para uso.
Os testes dilucionais para monitorar a acurácia dos resultados devem ser realizados com os
Antimicrobianos que fazem parte do antibiograma liberado pelo laboratório. Para cada gênero ou
espécie de bactérias ou classe de antimicrobiano são recomendadas cepas de referência específicas.
Os limites aceitáveis para as concentrações CIM (µg/mL) definidos para as cepas de referências
e os diversos antimicrobianos são descritos – em CLSI norma M100-S16 ou norma substituta.
4.6. TeSTeS de QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade
a) Condições dos testes e cepas de controle de qualidade usadas para monitorar a acurácia dos testes de
CIM (µg/mL).
enterobactérias
•Meio
.Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
.Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton
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m2 - C - 0
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
•Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/
inibidor de ß-lactamase)
Detecção de eSbl em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis
Testes de triagem de eSbl K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli
•Meio: Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
•Concentração de Antimicrobianos:
.Cefpodoxima 4µg/mL ou
. Ceftazidima 1µg/mL ou
. Aztreonam 1µg/mL ou
. Cefotaxima 1µg/mL ou
. Ceftriazona 1µg/mL
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
• Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
Testes de triagem de eSbl P. mirabilis
•Meio: Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
•Concentração de Antimicrobianos:
.Cefpodoxima 1µg/mL ou
.Ceftazidima 1µg/mL ou
. Cefotaxima 1µg/mL ou
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
•Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
Teste confirmatório de ESBL
• Meio: Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
• Concentração de Antimicrobianos:
. Ceftazidima 0,25 -128µg/mL
. Ceftazidima/ácido clavulanico 0,25/4 -128/4µg/mL
E
.Cefotaxima 0,25 -64µg/mL
. Cefotaxima/ácido clavulanico 0,25/4 -64/4µg/mL
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
• Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
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P. aeruginosa e outros não-enterobacteriaceas (inclue Pseudomonas spp., e outros bacilos grannegativos
não fastidiosos e não fermentadores exceto B. cepacia, B. mallei, B. pseudomallei, S.
maltophilia e Acinetobacter spp.)
•Meio
. Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
. Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
• Cepas de referência: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218
(para combinações ß-lactâmicos/inibidor de ß-lactamase)
Acinetobacter spp., Burkodelia cepacia, S. maltophilia
•Meio
.Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
.Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 20 a 24 horas
•Cepas de referência: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218
(para combinações ß-lactâmicos/inibidor de ß-lactamase)
Staphylococcus spp.
•Meio
.Diluição em caldo:
Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions + NaCl a 2% para oxacilina,
meticilina e nafcilina; Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions suplementado
com 50µg/mL de cálcio para daptomicina.
.Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton, Ágar Müeller-Hinton +NaCl a 2% para
oxacilina, meticilina e nafcilina. Diluição em ágar não é recomendada atualmente
para daptomicina.
•Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5
de McFarland.
•Incubação: 33 - 35oC, ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para oxacilina, meticilina,
nafcilina e vancomicina
•Cepas de referência: S. aureus ATCC 29213; E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/
inibidor de ß-lactamase); S. aureus ATCC BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de indução
à clindamicina)
Teste de triagem com ágar Oxacilina – NaCl para S. aureus
• Meio: Diluição em ágar:
Ágar Müeller-Hinton + NaCl a 4% m/v e 6µg/mL de oxacilina.
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5
de McFarland.
• Incubação: 35oC, ar ambiente, 24 horas.
• Cepas de referência: E. faecalis ATCC 29212 – sensível, E. faecalis ATCC 51299 -resistente.
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Teste de triagem com ágar Vancomicina para S. aureus
• Meio: Diluição em ágar:
Ágar BHI e 6µg/mL de vancomicina.
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5
de McFarland.
• Incubação: 35oC, ar ambiente, 24 horas.
• Cepas de referência: S. aureus ATCC 29213 – sensível, S. aureus ATCC 43300 - resistente
Enterococcus spp.
•Meio
. Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions ou Caldo Müeller-
Hinton ajustado com cátions suplementado com 50µg/mL de cálcio para daptomicina.
. Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton. Diluição em ágar não é recomendada atualmente
para daptomicina.
• Inóculo: Método de crescimento e suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para vancomicina.
•
Cepas de referência: E. faecalis ATCC 29212
Teste de triagem para alto nível de resistência a aminoglicosídeos e resistência a vancomicina para
Enterococcus spp. Tabela 2D – M100-S16
•Meio
.Diluição em ágar: Ágar BHI
.Antimicrobianos:
–6µg/mL de vancomicina ou
– 2000µg/mL de estreptomicina ou
– 500µg/mL de gentamicina.
. Diluição em caldo: meio BHI
. Antimicrobianos:
– 1000µg/mL de estreptomicina ou
– 500µg/mL de gentamicina.
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
. Ágar: colocar 10 µL da suspensão 0,5 de McFarland na superfície da placa
• Incubação: 35oC, ar ambiente, 24 horas.
• Cepas de referência: E. faecalis ATCC 29212 -sensível, E. faecalis ATCC 51299 -resistente.
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m2 - C -
Capítulo 2
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras
O CIQ tem como objetivo monitorar os seguintes aspectos:
• precisão (repetitividade) e acurácia (exatidão) dos resultados obtidos nos testes de sensibilidade;
• desempenho dos reagentes utilizados nos testes; e
• desempenho dos técnicos que executam os testes e realizam a leitura dos resultados.
Esse objetivo é mais facilmente atingido, com uso de cepas de referência que têm sua sensibilidade
aos antifúngicos pré-determinada. No entanto, isso não dispensa a adoção de outras medidas
que melhoram a qualidade dos resultados.
1. CePaS de reFerêNCIa9,10
1.1. CePaS reCoMeNdadaS Para TeSTeS de CIM de 48 HoraS Por dILuIção eM CaLdo
Faixa de leitura CIM: Ver tabela 4- M27-A2 ou norma substituta.
Candida parapsilosis ATCC 22019.
Candida krusei ATCC 6258.
1.2. CePaS reCoMeNdadaS Para TeSTeS de CIM de 24 e 48 HoraS Por MICrodILuIção eM CaLdo
Faixa de leitura CIM: Ver tabela 5- M27-A2 ou norma substituta.
Candida parapsilosis ATCC 22019.
Candida krusei ATCC 6258.
1.3. CePaS reCoMeNdadaS Para dISCo-dIFuSão
Candida parapsilosis ATCC 22019 – Intervalo de valores do halo de inibição (diâmetro em
mm), esperado em testes com discos de fluconazol (25 mg) -22-33mm.
Candida albicans ATCC 90028 – Intervalo de valores do halo de inibição (diâmetro em mm),
esperado em testes com discos de fluconazol (25 mg) -28-39 mm.
Candida tropicalis ATCC 750 – Intervalo de valores do halo de inibição (diâmetro em mm),
esperado em testes com discos de fluconazol (25 mg)-26-37mm.
2. MaNuSeIo e eSToCageM daS CePaS de reFerêNCIa
2.1. PreParo daS CePaS de reFerêNCIa Para arMazeNaMeNTo
• As suspensões-padrão, preparadas de acordo com o procedimento delineado a seguir, podem
ser mantidas indefinidamente, sem risco significativo de alteração nos perfis
de sensibilidade ao agente antifúngico.
• Para preparar as cepas para armazenamento, deve-se obedecer ao procedimento abaixo:
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m2 - C2 -
. Cultivar os organismos em placas de Petri, durante uma noite, em ágar Sabouraud-
dextrose, ou em ágar batata-dextrose, ou ágar enriquecido com digerido de
soja-caseína.
. Selecionar várias colônias e realizar testes de sensibilidade apropriados, para demonstrar
resultados esperados de sensibilidade, halo de inibição no método de
disco-difusão ou CIM na macrodiluição ou microdiluição (ver item anterior para
halos de referência ou Tabelas 4 e 5 do doc. M27A2 ou norma substituta para valores
esperados de CIM).
. Realizar uma subcultura das cepas, que produziram os resultados esperados, no mesmo
meio usado para a cultura primária e incubar para que ocorra crescimento suficiente
(em geral, de um a três dias).
. Examinar, com cuidado, a morfologia e cor das colônias para se certificar da
pureza da cultura.
. Suspender as colônias na solução estabilizante de glicerol a 50%, até fazer suspensão
densa ou, se estiver liofilizado, suspender no meio apropriado.
.Distribuir pequenos volumes (uma ou duas gotas) da suspensão turva em recipientes
estéreis recomendados para congelamento.
.Colocar esses recipientes em freezer (preferencialmente à – 60oC ou -20oC ) ou em nitrogênio
líquido.
.Quando o estoque de recipientes estiver praticamente exaurido, repete-se o processo
para produzir um novo estoque.
2.2. arMazeNaMeNTo daS CePaS de reFerêNCIa
•Para o armazenamento prolongado das cepas de referência. As leveduras devem ser cultivadas
em ágar batata-dextrose e depois congeladas a -70oC. Alternativamente, as cepas
de referência (não Criptococcus) podem ser cultivadas suspendendo as células fúngicas em
solução de glicerol a 50% em pequenos frascos e armazenados a -70oC.
•Para armazenamento de curto prazo, as culturas-padrão de trabalho, ou seja, de uso rotineiro
nos tstes, devem ser cultivadas a 35°C (+ 2°C) em tubos de ágar-Sabouraud ou ágar sangue,
em tubos inclinados, até se observar crescimento suficiente, sendo depois armazenadas
à temperatura de 2 a 8oC, enquanto não são utilizadas nos testes.
2.3. MaNuSeIo daS CePaS de reFerêNCIa NoS TeSTeS de roTINa
• Todas as culturas usadas em testes de sensibilidade a antifúngicos devem ser semeadas em
meio isentos de antibióticos, antes de serem submetidas às análises.
• As cepas de controle de qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e métodos
empregados para testes de isolados clínicos.
Para o uso das cepas de referência nos testes de rotina, é necessário realizar os seguintes
procedimentos:
•Retirar o recipiente da cultura do freezer ou frasco liofilizado.
• Deixar descongelar a suspensão congelada ou reidratar a cultura liofilizada.
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• Realizar uma subcultura, bem distribuída, em placa de Petri, contendo ágar batata-dextrose
e incubá-la a 35° C (+ 2°C) durante 24 horas.
• Retirar quatro ou cinco colônias, realizar subcultura em ágar Sabouraud-dextrose ou ágar
batata-dextrose e, após 24h, realizar testes de sensibilidade.
• As cepas-padrão, após seu crescimento a 35°C (+ 2°C) por 24 horas em ágar-batata-dextrose,
devem ser mantidas em geladeira, sob temperatura entre 2 a 8°C, como “cultura-padrão
de trabalho” para uso na rotina. Essas culturas devem ser substituídas de duas em duas
semanas, pelo menos, por outras do estoque congelado.
•Realizar sempre os testes de sensibilidade das colônias cultivadas durante uma noite.
•Os repiques das culturas de trabalho são preparados a cada duas semanas pelo método de
transferência seriada.
•A cada três repiques da cultura de trabalho, deve-se descongelar uma nova amostra para
uso em testes de rotina, para diminuir o risco de contaminação.
• Deve-se obter uma cultura de trabalho nova sempre que ocorrerem resultados aberrantes.
3. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade
3.1. INTerVaLoS de CIM
As Tabelas 4 e 5 (CLSI M27-A2 ou norma substituta) apresentam os intervalos de precisão dos
valores de CIM para um único teste de controle.
Em geral, um dentre 20 valores de CIM, em série de 20 testes consecutivos, pode estar fora
do controle (i.e., fora da faixa definida), devido às variações aleatórias do teste.
Dois resultados consecutivos, com valores fora do esperado ou mais de dois resultados fora do
esperado em 20 testes de controle consecutivos, exigem medidas corretivas. Toda vez que
se tomar medidas corretivas, a contagem de 20 testes consecutivos recomeça.
OBS.: Não confundir esse procedimento com o procedimento para estabelecer o desempenho
satisfatório dos testes de CIM visando à realização de testes de controle da qualidade mensais, ao
invés de diários.
3.2. TeSTeS de SeNSIBILIdade a aNTIFúNgICoS
Para monitorar o desempenho geral dos procedimentos para testes, recomenda-se incluir cepas
de referência apropriadas, todo dia que o teste for realizado.
Esse procedimento é apenas para estabelecer o desempenho satisfatório dos testes de CIM e
disco-difusão, com a finalidade de realizar testes de controle da qualidade mensais,
ao invés de diários. Esse procedimento não deve ser confundido com os passos que devem
ser seguidos para tomar as medidas de correção.
A freqüência do monitoramento dos testes pode ser diminuída se o laboratório puder docu
mentar desempenho satisfatório com testes de controle diários. Para esse fim, define-se
desempenho satisfatório da seguinte maneira:
• documentação que comprove que todas as cepas de referência foram testadas durante cinco
dias consecutivos de testes; e Tecnologia em Serviços de Saúde
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•para cada combinação droga-microrganismo, nenhum dos cinco valores de CIM (i.e., valores
de CIM obtidos para uma combinação droga-microrganismo durante cinco dias consecutivos
de testes) ou diâmetros dos halos de inibição podem estar fora do intervalo de acurácia
definidos nas Tabelas
4e 5 em CLSI M27-A2 ou norma substituta e item cepas de referência para leveduras.
Quando essas condições forem cumpridas, será preciso testar cada cepa de referência pelo menos
uma vez por mês2,6 e sempre que qualquer reagente ou artigo plástico for mudado.
Sempre que for constatado um valor de CIM ou diâmetro de halo fora do intervalo de acurácia,
usando o sistema de monitoramento mensal, será necessário recomeçar e manter os testes de con
trole diários enquanto não se definir qual é a fonte de erro para o resultado aberrante
e a resolução do problema não tiver sido documentada da seguinte maneira:
• realizar os testes com cepas de referência apropriadas durante cinco dias consecutivos;
• para cada combinação droga-microrganismo, os cinco valores de CIM (ex., valores de
CIM obtidos para uma combinação droga-microrganismo durante cinco dias consecutivos
de testes) devem se manter dentro do intervalo de acurácia definidos nas Tabelas 4 e 5
(CLSI M27-A2);
• se a solução do problema não puder ser documentada (ex., pelo menos um dos cinco valores
de CIM ou diâmetro do halo de inibição estiver fora do intervalo de acurácia) será necessário
continuar os testes diários de controle da qualidade;
• o retorno à adoção de testes mensais exige documentação do desempenho satisfatório durante
cinco dias consecutivos, conforme já descrito;
• no caso de algumas drogas, os testes de controle de qualidade devem ser efetuados com
freqüência maior do que uma vez por mês, devido à degradação relativamente rápida
da droga.
4.TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade doMeIo de CuLTura e arTIgoS de PLÁSTICo9
Para controle de lotes de meio de cultura e de artigos plásticos, o procedimento pode ser dividido
nos passos abaixo.
• Testar cada novo lote de meio usado em tubos de macrodiluição, ou lote de placas de microdiluição,
usando uma das cepas-controle da qualidade relacionadas na Tabela 4 CLSI
M27-A2 ou norma substituta para determinar se os valores de CIM estão dentro do intervalo
esperado; caso contrário, rejeitar o lote.
• Pelo menos um tubo de cada lote deve ser incubado, sem inocular, durante o mesmo período
necessário para realizar o teste, de maneira a se verificar a esterilidade do meio.
• Os lotes novos do meio RPMI-1640 devem ser testados para verificar se seu desempenho
será aceitável, antes de usá-los em testes de isolados clínicos, visto que estudos recentes
demonstram que alguns lotes não têm desempenho apropriado. O pH do meio RPMI-1640
pode variar de 6,9 a 7,1 e o pH do meio Müeller-Hinton deve ficar entre 7,2 e 7,4.
• Registrar os números de lote de todos os materiais e reagentes usados nesses testes.
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5.ouTroS TeSTeS de CoNTroLe uTILIzadoS
Na MaCrodILuIção e MICrodILuIção
5.1. CoNTroLe do CreSCIMeNTo
Cada série de tubos na macrodiluição deve incluir um controle de crescimento do meio RPMI
1640, sem agente antifúngico, para avaliar a viabilidade das leveduras em teste. Na microdiluição
uma coluna da placa de micro titulação é destinada a esse controle. Em testes de caldo, o controle do
crescimento também serve como controle da turbidez para a leitura dos pontos finais de reação.
5.2. CoNTroLe de Pureza
Uma alíquota de cada inóculo deve ser colocada numa placa de ágar Sabouraud-dextrose e in
cubada à temperatura de 35°C + 2°C até haver crescimento suficiente para detectar possíveis
culturas mistas e prover novas colônias isoladas para o caso de se tornar necessário repetição do teste.
5.3. CoNTroLe da LeITura doS PoNToS FINaIS da reação
Aleitura dos pontos finais da reação deve ser monitorada, periodicamente, para minimizar
possíveis variações nos resultados de testes de CIM, realizados por diferentes observadores. Todo pessoal
de laboratório que realiza esses testes deverá ler, separadamente, um conjunto selecionado de testes de
diluição. Os resultados devem ser registrados e comparados com os resultados obtidos por um técnico
experiente. As cepas de referência, com valores de CIM pré-determinados, são particularmente úteis para
essa finalidade, especialmente, em testes com fluconazol, em que pode ocorrer o fenômeno de trailing.
6.TeSTe da QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade
a) Condições dos testes e cepas de controle da qualidade usadas para monitorar a acurácia dos testes de CIM (µg/mL)
•Meio: Diluição em caldo: Meio RPMI -1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indicador
vermelho fenol) pH 7,0 ± 0,1.
•Inóculo: As diferentes operações de preparo do inóculo são as abaixo.
.Deve-se realizar a subcultura (repique) dos organismos, em tubos estéreis com ágar
Sabouraud dextrose ou ágar batata-dextrose, executando passagens para assegurar sua
pureza e viabilidade.
.O inóculo deve ser preparado escolhendo-se cinco colônias com diâmetro de ~1mm de
cultura de 24 horas para espécies de As colônias devem ser suspensas em 5mL de solução
salina estéril 0,145 mol/L (8,5g/L NaCl; salina a 0,85%).
.A suspensão resultante deve ser colocada em agitador de vórtex durante 15 segundos e a densidade
celular, ajustada com espectrofotômetro, acrescentando-se solução salina suficiente
para obter a transmitância equivalente de uma solução-padrão da escala 0,5 de McFarland
em comprimento de onda de 530nm. Esse procedimento fornece uma suspensão-padrão de
levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 células por mL A suspensão de trabalho é produzida fazendo-
se uma diluição 1:100 seguida de uma diluição de 1:20 da suspensão-padrão com meio
líquido RPMI 1640, resultando em concentração de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 células por mL.
•Incubação:
A temperatura de incubação deve permanecer em 35° C. Tecnologia em Serviços de Saúde
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Capítulo 3
Controle da qualidade em testes de sensibilidade
realizado por Métodos Automatizados
1. eLeMeNToS eSSeNCIaIS do SISTeMa de geSTão da QuaLIdade
1.1. FaSe Pré-aNaLíTICa
a) representante/empresa responsável pelo equipamento
•Manual de funcionamento do equipamento no idioma do país.
•Registro nacional e certificado de funcionamento in situ do equipamento e de qualidade dos
lotes dos reagentes.
• Plano de manutenção preventiva e corretiva do equipamento.
• Programa de capacitação para o uso apropriado do equipamento.
• Fornecimento de cepas ATCC para o controle interno de qualidade de acordo com as especificações
do equipamento.
•Atualização do software a cada mudança.
• Comunicação escrita dos problemas registrados que impliquem em mudança da qualidade
dos resultados.
B) usuário
• Manual de procedimento do laboratório para o uso do sistema automatizado.
• Capacitação de pessoal no uso do equipamento.
• Programa de manutenção preventiva e corretiva do equipamento.
• Notificação, à autoridade competente, de forma escrita, dos problemas
registrados que impliquem em mudanças na qualidade dos resultados obtidos.
1.2. CoNTroLe INTerNo do LaBoraTórIo
a) Controle de temperatura
•Registro diário da temperatura ambiental.
•Registro diário da temperatura interna do equipamento.
•Registro de alertas do equipamento.
•Registro das medidas corretivas tomadas.
B) Preparo e padronização do inóculo
• Se for utilizado turbidimetro, deve-se calibrar e registrar diariamente transmitância.
• Definir e registrar a forma e a freqüência do controle de esterilidade da solução
de trabalho.
1.3. CoNTroLe da QuaLIdade doS ProCeSSoS auToMaTIzadoS
A) Lista de cepas de referência recomendadas para testes de identificação
Recomenda-se testar no mínimo uma cepa de referência por painel.
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Para painéis de gram negativos:
• E. coli 25922 (qualidade da prova).
• P. mirabilis 7002 (qualidade da prova de identificação de bacilos Gram-).
• K. pneumoniae 13883 (qualidade da prova de identificação de bacilos
Gram-). Para painéis de gram positivos:
• S. aureus 29213 (qualidade da prova de identificação de bacilos Gram+).
• E. faecalis 29212 (qualidade da prova de identificação de bacilos
Gram+). Para painéis de levaduras:
•C. albicans 14053 (qualidade da prova de identificação de levaduras).
B) Lista de cepas de referência recomendadas para testes de sensibilidade
Para painéis de gram negativos:
•E. coli 25922 (qualidade da prova).
•E. coli 35218 (para inibidores de ß lactamase).
• E. coli 51446 (ESBL).
• P. aeruginosa 27853 (concentração de cátions e pH com aminoglicosídeos).
• E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).
Para painéis de gram positivos:
• S. aureus 29213 (qualidade da prova).
• E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).
• E. faecalis 51299 (resistência a vancomicina).
• E. coli 35218 (para inibidores de ß lactamase).
1.4. VaLIdação
a) Protocolo de controle da qualidade diário
Prova diária por 5 dias
•Sem erro, seguir com o controle periódico.
•= 1de cada 5 ensaios apresentarem erro, tomar ações corretivas:
. erro óbvio6: testar novamente no mesmo dia e, se o resultado for o esperado, continuar
com as provas diária.
. erro não óbvio6: testar novamente no mesmo dia e controlar por cinco dias consecutivos.
Se todos os resultados estiverem dentro do esperado, passar ao controle mensal.
B)Protocolo de controle da qualidade periódico
• Recomenda-se realizar os controles a cada mês, utilizando as listas de cepas de referência
acima mencionadas. Também deve ser realizado um controle a cada troca de
lote do painel.
• Se os testes mensais apresentarem erros, tomar ações corretivas e retornar aos testes
de CIQ diários.
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Referências
Bibliográficas
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MICROBIOLOGY. http://w3.whosea.org/EN/Section10/Section17/Section53/Section482_
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anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/index.htm
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5. Ivonne D. Rankin. Aseguramiento de Calidad/Control de Calidad (AC/CC) 65. In: Manual de
Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana. Editora Coordinadora Marie B. Coyle American
Society for Microbiology - Organizacion Panamericana de la Salude. 2005
6. NCCLS/CLSI -Padronização dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Disco—difusão:
Norma Aprovada – Nona Edição. Documento M2-A9 Vol.26 Nº 1. Substitui a Norma
M2-A8. Vol. 23 Nº 1
7. NCCLS/CLSI -Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 16o
Suplemento Informativo. Documento M100—S16. Vol. 26 Nº 3 - Substitui a Norma M100-S15
Vol. 25 Nº 1.
8. NCCLS/CLSI -Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição
paa Bactéria de Crescimento Aeróbico: Norma Aprovada – Sexta Edição. Documento M7—A7.
Vol. 26 Nº 2. Substitui a Norma M7-A6 Vol. 23 Nº 2.
9. NCCLS/CLSI - Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para Determinação da
Sensibilidade de Leveduras à Terapia Antifúngica: Norma Aprovada – Segunda Edição. Documento
M27-A2 Vol. 22 Nº 15 — Substitui a Norma M27-A. Vol. 17 Nº 9
10. NCCLS/CLSI -Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Approved
Guideline. NCCLS document M44-A Volume 24 Number 15.
11. Programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos – PALC. Lista de requisitos PALC. Sociedade
Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial (SBPC/ML), 2004. http://www.sbpc.
org.br/files/pdf/Requisitos_PALC_versao2004.pdf
12. RelatóriofinaldeComitédeExpertosenlaevaluacióndeldesempeñoparalaidentificaciónbacteriana
y antibiograma con métodos automatizados Brasilia, Brasil. 26 -28 octubre 2004. Vol. 23 Nº 1
13. Reimer, LG and Carrol, K.C. Procedures for Storage of Microorganisms. In: Manual of Clinical
Microbiology, cap.7, 67-73, 8ª edição, 2003.
Tecnologia em Serviços de Saúde
Fonte: Anvisa
Link dessa matéria com ilustracões: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/manual_testes_antimicrobianos.pdf
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